Trong Thế chiến II, B-25 Mitchell được sử dụng cho nhiều nhiệm vụ ngoài ném bom, từ trinh sát, tuần tra đến huấn luyện và vận chuyển, cho thấy khả năng thích ứng của dòng máy bay hai động cơ này.
Với tổng sản lượng thường được thống kê ở mức 9.816 chiếc, B-25 Mitchell trở thành một trong những oanh tạc cơ hạng trung quan trọng nhất của Mỹ trong Thế chiến II, phản ánh sức mạnh sản xuất và tổ chức hậu cần của nền công nghiệp quân sự Mỹ.
Sau khi Thế chiến II kết thúc, B-25 Mitchell tiếp tục phục vụ trong nhiều vai trò quân sự và dân sự, trở thành một trong những dòng oanh tạc cơ thời chiến được bảo tồn và khai thác lâu dài.
Ngày 18/4/1942, 16 chiếc máy bay ném bom B-25 Mitchell cất cánh từ tàu sân bay USS Hornet, thực hiện cuộc không kích đầu tiên của Mỹ vào lãnh thổ Nhật Bản trong Thế chiến II.
Dù không được thiết kế để cất cánh từ tàu sân bay, oanh tạc cơ B-25 Mitchell vẫn trở thành lựa chọn của Mỹ cho cuộc không kích táo bạo Nhật Bản ngày 18/4/1942, mở ra một chương đặc biệt trong lịch sử hàng không quân sự.
B-25 Mitchell không phải máy bay ném bom lớn nhất của Mỹ trong Thế chiến II, nhưng thiết kế hai động cơ, khả năng mang bom và tính linh hoạt đã giúp dòng máy bay này liên tục phục vụ trên nhiều chiến trường.