Hoạt tính kháng oxy hóa của cao chiết ethanol Trắc bá diệp (Thuja orientalis L.)

TÓM TẮT:

Nghiên cứu này nhằm mục đích khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa của dịch chiết ethanol của cây Trắc bá diệp (lá và cành) sử dụng các phương pháp kháng oxy hóa khác nhau như phương pháp DPPH, ABTS•+, năng lực khử (reducing power), khử sắt (Ferric ions Reducing Ability Power) và phosphomolybdenum (kháng oxy hóa tổng). Kết quả cho thấy, dịch chiết ethanol của cây Trắc bá diệp thể hiện hoạt tính kháng oxy hóa tốt trong các phương pháp thử nghiệm. Kết quả này cũng phù hợp với sự hiện diện các thành phần có hoạt tính sinh học như polyphenol và flavonoid trong cao chiết. Nghiên cứu này mở ra hướng mới trong việc sử dụng thực vật này trong lĩnh vực Y Dược.

Từ khóa: Kháng oxy hóa, cây Trắc bá diệp (Thuja orientalis), flavonoid, polyphenol.

1. Mở đầu

Stress oxy hóa và việc sản xuất quá nhiều gốc tự do trong cơ thể là nguyên nhân gây ra nhiều bệnh nguy hiểm như ung thư, tim mạch, thoái hóa thần kinh, xơ vữa động mạch, tiểu đường [1]. Các hợp chất chống oxy hóa như polyphenol và flavonoid có tác dụng loại bỏ gốc tự do và do đó ức chế cơ chế oxy hóa dẫn đến các bệnh thoái hóa [2]. Trong những năm gần đây, có nhiều nghiên cứu được tiến hành nhằm tìm ra các hợp chất từ tự nhiên và tổng hợp có tác dụng kháng oxy hóa, ngăn chặn các bệnh do quá trình oxy hóa gây ra đang được quan tâm và đẩy mạnh. Tuy nhiên, việc sử dụng các chất từ tổng hợp cũng gây ra nhiều tác dụng phụ. Do đó, việc sử dụng các hợp chất chiết xuất từ tự nhiên có khả năng kháng oxy hóa không gây tác dụng phụ cho sức khỏe là lựa chọn hàng đầu trong việc nâng cao chất lượng thực phẩm, mỹ phẩm và dược phẩm.

Trắc bá diệp (Thuja orientalis) là loài cây trồng làm cảnh và làm thuốc trên nhiều vùng ở Việt Nam. Trắc bá diệp có vị chát, đắng, hơi hàn có tác dụng cầm máu, chữa thổ huyết, máu cam, lỵ ra máu. Bá tử nhân vị ngọt, tính bình, có tác dụng bổ tâm, tỳ định thần dùng chữa hồi hộp, mất ngủ, hay quên, người yếu ra nhiều mồ hôi, táo bón [3].

Các nghiên cứu trên thế giới cho thấy rằng, thực vật này thể hiện nhiều hoạt tính sinh học như thúc đẩy sự tăng trưởng của tóc, kháng virus, kháng dị ứng, chống động kinh, kháng khuẩn và nấm, kháng viêm [4]. Tinh dầu lá Trắc bá diệp ức chế sự phát triển một số vi khuẩn và nấm [5, 6]. Cao chiết từ vỏ cây và quả có tác dụng ức chế enzyme lipase [7]. Hợp chất từ tinh dầu của lá, α-pinene, có khả năng cải thiện trí nhớ, phòng ngừa và điều trị các bệnh do thoái hóa thần kinh như chứng mất trí nhớ hay rối loạn nhận thức [8], α-cedrol có tác dụng kháng nấm Alternaria alternate [6], các hợp chất flavonoids phân lập từ cao chiết methanol quả có hoạt tính kháng oxy hóa và hoạt tính ức chế neutropil elastase ở người [9].

Một số nghiên cứu về thành phần hóa học ngoài nước thực hiện trên tinh dầu lá Trắc bá diệp cho thấy tinh dầu chứa các hợp chất terpenoids như monoterpen, sesquiterpen… [6,10]. Cao methanol trái chứa các flavonoids như cupressuflavone, amentoflavone, robustaflavone, myricitrin, (+)-catechin, quercitrin, hypolaetin, isoquercitrin 7-O-β-xylopyranoside và afzelin [9].

Trong nước, nghiên cứu của Đinh Ngọc Thức và cộng sự cho thấy tinh dầu của lá Trắc bá diệp chứa các thành phần terpenoids và thể hiện hoạt tính kháng vi khuẩn [11]. Nguyễn Thị Thảo Ly và cộng sự cũng phân lập được một số hợp chất từ cao hexan của lá như acid ferulic, 3-oxo-α-ionol, acid pinusolidic, acid 3β-hydroxyisopimaric, 7-hydroxy-5, 6, 4′-trimethoxyflavon, n-docosyl frulat [12]. Theo tìm hiểu của chúng tôi, cho đến hiện nay, các nghiên cứu về hoạt tính sinh học của cây trắc bá diệp trong nước vẫn còn hạn chế. Vì vậy, nghiên cứu này được thực hiện nhằm đánh giá hoạt tính kháng oxy của cây trắc bá diệp với mục đích tìm kiếm thêm nguồn thảo dược trong thiên nhiên phục vụ cho bảo vệ sức khỏe con người.

2. Thực nghiệm 2.1. Nguyên liệu

Cây Trắc bá diệp (phần lá và cành cây tươi) được thu hái tại huyện Chợ Lách, tỉnh Bến Tre vào tháng 1/2018 được định danh bởi Thạc sĩ Phùng Thị Hằng, Bộ môn sư phạm Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ. Mẫu thực vật (BT_Thu 2018010001) được lưu giữ tại Phòng thí nghiệm Hóa sinh, Khoa Khoa học Tự nhiên, Trường Đại học Cần Thơ. Mẫu thực vật dùng làm thí nghiệm được rửa sạch, phơi khô và nghiền thành bột. Bột được trữ trong tủ đông -200C cho đến khi thí nghiệm.

Bột khô (100g) được cho vào túi vải, cột kín, ngâm trong 1L dung môi ethanol 96° mỗi lần ngâm trong 24 giờ (ngâm 3 lần). Sau đó dịch chiết được lọc qua giấy lọc rồi tiến hành cô quay dưới áp suất thấp ở nhiệt độ khoảng 55°C, đuổi hết dung môi thu được cao chiết ethanol trắc bá diệp. Cao thô dạng sệt được bảo quản ở nhiệt 4°C dùng làm thí nghiệm.

2.2. Định tính thành phần hóa học các cao chiết

Thành phần hóa học của các cao chiết như: alkaloid, flavonoid, steroid và triterpene, glycoside, hợp chất phenolic và tannins được định tính bằng các thuốc thử đặc trưng [13]

2.3. Định lượng polyphenol tổng và flavonoid tổng trong cao chiết

Hàm lượng polyphenol được xác định bằng thuốc thử Folin-Ciocalteu theo mô tả của Rebaya et al., 2014 [14]. Hàm lượng flavonoid toàn phần trong các cao chiết được xác định theo phương pháp so màu AlCl3 của Bag et al., 2015 [15].

2.4. Khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa của cao chiết

Khảo sát hiệu quả loại bỏ gốc tự do DPPH

Khả năng loại bỏ gốc tự do DPPH của các cao chiết Trắc bá diệp được được thực hiện theo Sharma et al., 2009 [16]. Hỗn hợp phản ứng gồm 40 µL DPPH (1000 µg/mL) và 960 µL cao ethanol (ở các nồng độ từ 0 – 350 µg/mL) ủ trong tối ở nhiệt độ phòng trong thời gian 30 phút, đo độ hấp thụ quang phổ ở bước sóng 517 nm. Đối chứng dương sử dụng là vitamin C. Kết quả hoạt tính kháng oxy hóa của các cao chiết được biểu diễn bằng giá trị EC50 (Effective Concentration of 50%) được tính dựa trên phương trình tuyến tính của dịch chiết khảo sát.

Khảo sát hiệu quả loại bỏ gốc tự do ABTS•+

Hoạt động loại bỏ gốc tự do ABTS•+ thực hiện theo Nenadis et al., 2004 [17]. Chuẩn bị dung dịch ABTS•+: 2 mL dung dịch ABTS•+ 7 mM và 2 mL dung dịch K2S2O8 2,45 mM, ủ trong bóng tối 16 giờ, sau đó pha loãng bằng ethanol (khoảng 30 lần), điều chỉnh độ hấp thu ở bước sóng 734 nm đến 0,7±0,05. Tiến hành cho 990 µL ABTS•+ vào 10 µL cao ethanol (ở các nồng độ từ 0 - 70 µg/mL). Hỗn hợp phản ứng được ủ trong thời gian 6 phút. Sau đó, đo độ hấp thụ quang phổ ở bước sóng 734 nm. Đối chứng dương được sử dụng là trolox. Kết quả hoạt tính kháng oxy hóa của các cao chiết được biểu diễn bằng giá trị EC50 (Effective Concentration of 50%) được tính dựa trên phương trình tuyến tính của dịch chiết khảo sát.

Khảo sát năng lực khử (Reducing Power - RP)

Năng lực khử sắt (RP) được thực hiện theo phương pháp
Ferreira et al., 2007[18]. Hỗn hợp phản ứng gồm 0,5 mL cao ethanol (ở các nồng độ từ 0 - 500 µg/mL), 0,5 mL đệm phosphate (0,2 M, pH = 6,6) và 0,5 mL K3Fe(CN)6 1%. Sau đó hỗn hợp phản ứng được ủ ở 50ºC trong 20 phút, thêm 0,5 mL CCl3COOH 10% rồi ly tâm 3000 vòng/ phút trong 10 phút. Nhẹ nhàng rút 0,5 mL cho vào 0,5 mL nước và 0,1 mL FeCl3 0,1%, lắc đều. Đo độ hấp thụ quang phổ của hỗn hợp phản ứng ở bước sóng 700 nm. Chất đối chứng dương sử dụng là butylated hydroxianisole (BHA). Hiệu quả kháng oxy hóa của các cao chiết ở các nồng độ khác nhau được so sánh với chất chuẩn bằng cách sử dụng nồng độ mà tại đó chất chuẩn hay cao chiết (µg/mL) có giá trị OD = 0,5 (OD0,5).

Khảo sát khả năng khử sắt (FRAP)

Khả năng khử sắt FRAP được thực hiện theo Benzie and Strain, 1996 [19]. Tiến hành cho 10 µL cao ethanol (ở các nồng độ từ 0 - 45 µg/mL) vào 990 µL dung dịch FRAP. Các hỗn hợp trên được ủ ở 37oC trong 10 phút, sau đó tiến hành đo giá trị độ hấp thụ quang phổ ở bước sóng 593 nm. Đối chứng dương sử dụng là trolox. Hiệu quả kháng oxy hóa của các cao chiết ở các nồng độ khác nhau được so sánh với chất chuẩn bằng cách sử dụng nồng độ mà tại đó chất chuẩn hay cao chiết (µg/mL) có giá trị OD = 0,5 (OD0,5).

Khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa tổng (Phương pháp phosphomolybdenum)

Phương pháp dựa trên sự khử của Mo(VI) về Mo(V) thể hiện qua sự tạo phức Mo(V) – Phosphate màu xanh lá ở pH acid (Prieto et al., 1999 [20]). Tiến hành cho 100 µL cao ethanol (ở nồng độ từ 0 - 120 µg/mL) vào 900 µL dung dịch phosphomolybdenum. Các hỗn hợp trên được ủ ở 950C trong 90 phút, sau đó tiến hành đo giá trị độ hấp thụ quang phổ ở bước sóng 695 nm. Đối chứng dương sử dụng là vitamin C. Hiệu quả kháng oxy hóa của các cao chiết ở các nồng độ khác nhau được so sánh với chất chuẩn bằng cách sử dụng nồng độ mà tại đó chất chuẩn hay cao chiết (µg/mL) có giá trị OD = 0,5 (OD0,5).

3. Kết quả và thảo luận 3.1. Định tính thành phần hóa học cao chiết

Kết quả định tính thành phần hóa học cao chiết ethanol cho thấy sự có mặt của flavonoid, alkaloid, hợp chất phenolic và tannin, steroid, glycoside. Kết quả này cũng khá phù hợp với nghiên cứu của Jasuja1 et al. 2013 [21]. Nhóm chất flavonoid và polyphenol đã được biết đến là những nhóm hợp chất có hoạt tính kháng oxy hóa tốt. Từ việc định tính cho thấy trong lá và cành cây Trắc bá diệp chứa nhiều các nhóm hợp chất có tiềm năng sinh học.

3.2. Hàm lượng polyphenol tổng và flavonoid tổng

Hàm lượng polyphenol tổng và flavonoid tổng trong các cao chiết được xác định tương đương hàm lượng gallic acid, quercetin với phương trình đường chuẩn y = 0,1052x + 0,083 (R² = 0, 9999) và y = 0,0053x + 0, 0068 (R2 = 0, 9923) tương ứng. (Bảng 1)

Bảng 1. Hàm lượng polyphenol tổng và flavonoid tổng của cao chiết

3.3. Hoạt tính kháng oxy hóa

Bảng 2. Giá trị EC50 (OD0,5) của cao chiết ethanol với các phương pháp kháng oxy hóa

Ghi chú: Chất chuẩn trong cột theo thứ tự vitamin C, trolox, BHA, trolox, vitamin C

Kết quả cho thấy, cao chiết ethanol của Trắc bá diệp cho hiệu quả kháng oxy tốt trong các phương pháp thử nghiệm. Hiệu quả tốt trong các phương pháp ABTS•+, FRAP và Phosphomolybden với giá trị EC50 thấp hơn nhiều (< 100μg/mL) so với phương pháp DPPH và RP. Tuy nhiên, hiệu quả này vẫn còn thấp hơn so với các đối chứng dương. Tùy theo phương pháp và điều kiện phản ứng tiến hành khác nhau mà các hoạt chất từ cao chiết sẽ cho khả năng phản ứng khác nhau. Kết quả này cũng phù hợp với kết quả định tính, định lượng thành phần hóa học cao chiết ethanol cho thấy có chứa polyphenol và flavonoid. Theo sự hiểu biết của chúng tôi, các nghiên cứu trong và ngoài nước về hoạt tính kháng oxi hóa của cao chiết lá Trắc bá diệp vẫn còn hạn chế. Một số tác giả chỉ sử dụng riêng rẽ các phương pháp như DPPH, ABTS•+, RP, hoặc kết hợp 2 phương pháp khi khảo sát hoạt tính kháng oxi hóa. Điều này cũng còn nhiều hạn chế khi xác nhận hoạt tính kháng oxy, bởi vì sự hiện diện hỗn hợp thành phần các hợp chất có hoạt tính trong cao chiết có thể hiệu quả đối với phương pháp thừ nghiệm này nhưng không hiệu quả đối với phương pháp khác. Nghiên cứu này thể hiện ưu điểm là sự kết hợp của 5 phương pháp khác nhau để đánh giá hiệu quả kháng oxy hóa của trắc bá diệp. Nghiên cứu của Elsharkawy et al. (2017) cho thấy, dịch chiết Trắc bá diệp cho hiệu quả kháng oxy hóa (phương pháp DPPH) 73,35 % ở nồng độ 300μg/mL (EC50 = 202, 46μg/mL) [22], Nazir et al.(2016) báo cáo dịch chiết methanol của cây cùng chi Thuja occidentalis cho hoạt tính kháng oxy hóa bằng phương pháp DPPH ở hàm lượng 490μg/mL và ABTS•+là 450μg/mL [23]. Nizam et al. (2017) báo cáo dịch chiết ethanol của lá cho hiệu quả kháng oxy hóa bằng phương pháp DPPH và năng lực khử khá cao (>500μg/mL) so với nghiên cứu này [24]. Tuy nhiên, nghiên cứu của Jasujal et al., (2016) cũng cho thấy hoạt tính kháng oxy hóa của cao chiết methanol 70% bằng phương pháp DPPH có hiệu quả ức chế 85,25% ở nồng độ 100μg/mL [21]. Kết quả tốt hơn so với kết quả trong nghiên cứu này bởi dung môi methanol-nước sẽ hòa tan tốt các hợp chất flavonoid và polyphenol hơn so với dung môi ethanol. Điều này cũng phù hợp với hàm lượng polyphenol và flavonoid trong cao chiết của Jasujal et al., (2016) lớn hơn trong nghiên cứu này (95 và 100 mg/g).

4. Kết luận

Nghiên cứu hoạt tính kháng oxy hóa của cao chiết lá và cành cây Trắc bá diệp cho thấy cây cho hoạt tính kháng oxy hóa tốt. Kết quả này cũng phù hợp với sự hiện diện của các thành phần polyphenol và flavonoid, cũng như hàm lượng xác định của nó có trong cao chiết.

TÀI LIỆU THAM KHẢO:

Lee, J., Koo, N., Min, D.B., 2004. Reactive oxygen species, aging, and antioxidative nutraceuticals. Comprehensive reviews in food science and food safety 3: 21-33.
Wu, Y.Y., Li, W., Xu, Y., Jin, E.H., Tu, Y.Y., 2011. Evaluation of the antioxidant effects of four main theaflavin derivatives through chemiluminescence and DNA damage analyses. Journal of Zhejiang University Science B12: 744-751.
Đỗ Tất Lợi, 2004. Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam. Nhà xuất bản Y học.
Jain, N. and Ethanobotany, M. S., 2017. Phytochemical and Pharmacological Aspects of Thuja orientalis: A Review. International Journal of Pure and Appied Bioscience 5 (4): 73-83.
Jain, R. K. and Garg, S. C., 1997. Antimicrobial Activity of The Essential Oil Of Thuja Orientalis L. Ancient science of Life 16(3): 186-189.
Sanjay, G., Ashok, K., and Ashok, K. T., 2007. Chemical Composition and Fungitoxic Activity of Essential Oil of Thuja orientalis L. Grown in the North-Western Himalaya. Z. Naturforsch 63c: 211-214.
Kim, H. Y., and Kang, M. H., 2005. Screening of Korean Medicinal Plants for Lipase Inhibitory Activity. Phytotherapy research 19 (4): 359–361.
Lee, G-Y., Lee, C., Park, G. H., and Jang, J-H., 2017. Amelioration of Scopolamine-Induced Learning and Memory Impairment by α-Pinene in C57BL/6 Mice. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine 2017: Article ID 4926815, 9 pages https://doi.org/10.1155/2017/4926815.
Xu, G-H., Ryoo, I-J., Kim, Y-H., Choo, S-J., and Yoo, I-D., 2009. Free Radical Scavenging and Antielastase Activities of Flavonoids from the Fruits of Thuja orientalis. Archives of Pharmacal Research 32(2): 275-282.
Suresh, S. K., and Ramavtar, S., 2016. Essential oil constituents and antimicrobial potency of Thuja orientalis grown in Rajasthan. Suresh Gyan Vihar University International Journal of Environment, Science and Technology 2(2): 1-7.
Đinh Ngọc Thức, Nguyễn Thị Hà, Mai Thị Tho và Lê Nguyễn Thành, 2017. Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính kháng sinh của tinh dầu cây trắc bách diệp (Platycladus orientalis (L.) Franco). Tạp chí Dược học 57 (5).
Nguyễn Thị Thảo Ly, Nguyễn Diệu Liên Hoa và Nguyễn Thị Lệ Thu, 2016. Khảo sát thành phần hóa học cao hexan của lá cây trắc bách diệp (Biota Orientalis). Tạp chí Phân tích Hóa, Lý và Sinh học 20.
Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007. Phương pháp cô lập hợp chất hữu cơ. NXB Đại học Quốc gia TP. Hồ Chí Minh. Trang 80-138.
Rebaya, A., Belghith S.I., Baghdikian B., Leddet V. M., Mabrouki F., Olivier E., Cherif J. K., Ayadi, M.T., 2014. Total phenolic, total flavonoid, tannin content, and antioxidant capacity of Halimium halimifolium (Cistaceae). Journal of Applied Pharmaceutical Science 5(1): 52-57.
Bag, G.C., Devi P.G., Bhaigyabati Th., 2015. Assessment of Total Flavonoid Content and Antioxidant Activity of Methanolic Rhizome Extract of Three Hedychium Species of Manipur Valley. International Journal of Pharmaceutical Sciences Review and Research 30(1): 154–159.
Sharma, O. P., and Bhat, T. K., 2009. DPPH antioxidant assay revisited. Food chemistry 113(4): 1202-1205.
Nenadis, N., Wang, L-F., Tsimidou, M., and Zhang, H-Y., 2004. Estimation of Scavenging Activity of Phenolic Compounds Using the ABTS•+ Assay. Journal of Agricultural and Food Chemistry 52: 4669-4674.
Ferreira, I. C. F. R, Baptista, P., Vilas-Boas M., and Barros L., 2007. Free-radical scavenging capacity and reducing power of wild edible mushrooms from northeast Portugal: Individual cap and stipe activity. Food chemistry 100(4): 1511-1516.
Benzie, I. F., and Strain, J. J., 1996. The ferric reducing ability of plasma (FRAP) as a measure of “antioxidant power”: the FRAP assay. Analytical Biochemistry 239(1): 70-76.
Prieto, P., Pineda, M., Aguilar, M., 1999. Spectrophotometric quantitation of antioxidant capacity through the formation of a phosphomolybdenum complex: Specific application to the determination of vitamin E. Analytical Biochemistry 269(2): 337-341.
Jasuja1, N. D., Sharma, S. K., Saxena, R., Choudhary, J., Sharma, R., and Joshi, S. C., 2013. Antibacterial, antioxidant and phytochemical investigation of Thuja orientalis leaves. Journal of Medicinal Plants Research 7(25): 1886-1893.
Elsharkawy, E.,R., Aljohar, H., and Donia, A. E. R. M., 2017. Comparative Study of Antioxidant and Anticancer Activity of Thuja orientalis growing in Egypt and Saudi Arabia. British Journal of Pharmaceutical Research 15(5): 1-9.
Nazir, M. Z., Chandel, S., and Sehgal, A., 2016. In vitro screening of antioxidant potential of Thuja occidentalis. Journal of Chemical and Pharmaceutical Research 8(8): 283-286.
Nizam, I., and Mushfiq, M., 2017. Antioxidant activity of water and alcohol extracts of Thuja orientlis leaves. Oriental pharmacy and Experimental medicine 7(1): 65-73.

ANTIOXIDANT ACTIVITIY OF THE ETHANOLIC EXTRACT OF THUJA ORIENTALIS

Nguyen Trong Tuan

Vo Van Luan

Faculty of Natural Sciences, Can Tho University

ABSTRACT:

This research is to investigate the antioxidant activity of the ethanolic extract of Thuja orientalis leaf and bough by using different antioxidant models of screening such as the methods of DPPH, ABTS•+, Reducing Power (RP), Ferric ions Reducing Ability Power (FRAP), and phosphomolybdenum (total antioxidant activity). The result shows that the ethanolic extract exhibited the good antioxidant activity in testing methods. In addition, the results of prelimarily chemical constituents and total polyphenol and flavonoid contents show that the ethanolic extract contained lots of high bioactive components which fit with the good antioxidant activity of the ethanolic extract. This research is expected to open a new direction for using this plant in the medicinal field in the future.

Keywords: Antioxidant, Thuja orientalis, flavonoid, polyphenol.